孟加拉玫瑰红

方法一、重组TNFα的工艺过程细菌发酵 将工程菌接种于LB培养基，37℃震荡培养至A600nm=1，转至M9培养基，于42℃诱导4h。离心，收集菌体。用pH为8的磷酸盐缓冲液(PB，10mmol/L)悬浮菌体，并用超声破碎菌体，离心收集上清液，对PB透析，得TNFα粗品。工程菌[培养、发酵]→[37℃、42℃]发酵菌体[10mmol/L PB]→[pH8]TNFα粗品DEAE-Sepharose FF 离子交换柱层析 离子交换柱用PB平衡，加TNFα粗品，用PB洗柱，再加7
5 mmol/L NaCl洗脱，收集各峰，测TNFα活性。TNFα粗品[DEAE-Sepharose FF离子柱]→[7
5 mmol/L NaCl]TNFα活性组分IQ-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH 8、2
0 mmol/LTris-HCl缓冲液平衡，然后加TNFα活性组分I，用8
0 mmol/L NaCl洗脱，收集各峰，测TNFα活性，得TNFα活性组分II。TNFα活性组分I[Q-Sepharose FF离子柱]→[8
0 mmol/L NaCl]TNFα活性组分IICM-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH为6的10mmol/L PB平衡，加TNFα活性组分II，再依次用该PB液、PB液加200mmol/L NaCl及PB液加60
0 mmol/L NaCl分步洗脱，收集各洗脱液，测TNFα活性，即得TNFα纯品(在4℃时，通过三次常压离子交换，电泳表明：PB液加60
0 mmol/L NaCl的洗脱峰为TNFα单一条带，可得TNFα纯品)。TNFα活性组分II[CM-Sepharose FF离子柱]→[PB、200及600mmol/L NaCl]TNFα纯品
方法二、对合成的TNFα突变改造突变改造 用多位点突变引物和PCR方法对合成的TNFα基因突变改造，使其第二位精氨酸密码子CGT变为赖氨酸密码子AAA，即得突变基因TNF-K2。TNFα基因[多位点突变引物、PCR方法]→TNF-K2转化、重组 将TNF-K2插入载体pSB-92的PL启动子下游，转化E．coliJM103，经酶切鉴定筛选转化子，得重组质粒pSB-TNF-K2。TNF-K2[pSB-92]→pSB-TNF-K2培养、诱导 将pSB-TNF-K2于30℃培养至对数生长期，于42℃诱导4h，即得突变体[Lys2]TNFα，其分子量为17kD，比活性为6.8×107U/mg 蛋白，是一种可溶性蛋白质。pSB-TNF-K2[30℃, 42℃, 4h]→[Lys2]TNFα.

用作银量法的吸附指示剂和生物染色剂。主要用于抗肿瘤和抗病毒综合征的治疗。